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Home Publicaciones Características generales de las enterotoxinas estafilocócicas

Características generales de las enterotoxinas estafilocócicas

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Las enterotoxinas estafilocócicas (EE), que se consideran como exotoxinas bacterianas, son proteínas de cadena simple de aminoácidos, tienen un peso molecular aproximado de 27,000 a 30,000 daltones, un punto isoeléctrico de 7.0 a 8.6 y presentan un pico de máxima absorción a 277 nm. Son resistentes a algunas enzimas proteolíticas como la tripsina y relativamente estables al calor. Son muy higroscópicas y, por lo tanto, altamente solubles en agua y en soluciones salinas. Con base en sus características antigénicas se han identificado 10 tipos de enterotoxinas estafilocócicas, la enterotoxina estafilocócica A (EEA), la B (EEB), tres tipos de EEC (EEC1, EEC2 y EEC3), la D (EED), la E (EEE) y recientemente la G (EEG), la H (EEH), la I (EEI) y la J (EEJ), que aún no se encuentran bien caracterizadas, pero se sabe que producen reacción emética en monos, al igual que las otras EE. en la Tabla 1 se muestran algunas características de las mismas.2,4,5,6,8,10,20,36,45,46,49

Composición Bioquímica

La composición de aminoácidos de las EE es muy similar, como se observa en la Tabla Nº 2. Todas ellas tienen un alto contenido de lisina, tirosina, ácido aspártico y ácido glutámico, y además presentan dos residuos de cisteína en el centro de la molécula, que se unen para formar un puente disulfuro. Dentro de su composición no se han encontrado carbohidratos, lípidos ni ácidos nucleicos.7,8.24 La composición de aminoácidos de la EEA, la EED y la EEE es muy similar, lo mismo que la composición de la EEB y las EECs. Por ejemplo, el número de residuos de metionina en las primeras tres enterotoxinas es de siete u ocho, mientras que en la EEB y las EECs solamente son uno o dos residuos; lo cual, aparentemente, no juega un papel importante en su antigenicidad, porque cada una de las enterotoxinas induce la producción de anticuerpos específicos cuando son inyectadas en conejos. Sin embargo, se ha visto que puede haber reacción cruzada entre la EEA y la EEE y entre la EEB y las EECs. Por otro lado, la secuencia de aminoácidos de la EEA, la EEB y la EEC revela un área de homología entre ellas; por lo tanto, esta área se ha propuesto como el sitio activo de estas moléculas.5,7,8 (Ver Tabla 3). Algunos investigadores piensan que el residuo de metionina en esta área de homología es significativo y están trabajando actualmente para tratar de sustituirlo y observar si se modifica la actividad biológica de la EEA, que es en donde se está realizando el estudio.

Estabilidad de las enterotoxinas

Las enterotoxinas estafilocócicas son más estables en muchos aspectos, en relación con otras proteínas. En su estado activo son resistentes a la desecación y a enzimas proteolíticas como la tripsina, la quimiotripsina, la renina y la papaína. La pepsina destruye la actividad de la EEB a un pH de 2, pero no actúa a valores de pH por arriba de 2.0. Esta resistencia a enzimas proteolíticas explica por qué las toxinas son activas cuando son ingeridas, aún en la presencia de pepsina, porque el pH del estómago es generalmente mayor que 2 después de la ingestión de alimentos.3,6

En cuanto a la inactivación de las enterotoxinas por radiaciones gama (g), Read y Bradshaw publicaron que dosis de 5 Mrad (con cobalto 60) se requieren para reducir la concentración de EEB en un regulador de Veronal (pH 7.2), de 31 mg/mL a menos de 0.7 mg/mL. En la leche fue necesaria una dosis de 20 Mrad para reducir la concentración de 30 mg/mL a menos de 0.5 mg/mL. Estos autores concluyeron que el proceso de irradiación usado para pasteurización o esterilización de los alimentos no inactiva las enterotoxinas.38

Desde 1931 hasta la fecha se han realizado un gran número de investigaciones en relación con su estabilidad. En las Tablas Nº 4 y 5 se resumen los resultados más relevantes. En la Tabla Nº 4 se observa que el valor Z para la EEB es mayor que para la EEA, lo que indica que la EEB es más resistente al calor. En la Tabla Nº 5 se ve que la EEC, después de calentarse en las condiciones señaladas, conserva un porcentaje alto de actividad, y que la EEA y la EED son menos resistentes al calor. Se observa también que, después de un tiempo de almacenamiento, hay reactivación de las enterotoxinas, y que la EED requiere de un tratamiento con un desnaturalizante químico para que se reactive. Se resalta el hecho de que la inactivación de la mayoría de las enterotoxinas fue más rápida a temperaturas de calentamiento más bajas.49

Soo y colaboradores investigaron el efecto del calor en las EEA y EED adicionadas en leche, leche descremada, crema, queso y salchichas. Sus resultados mostraron que se pierde muy poca toxina en la leche, la leche descremada y la crema, aplicando una temperatura de 72°C durante 15 segundos (pasteurización). También encontraron que era muy difícil inactivar esas enterotoxinas sin afectar estos productos; en 100 g de salchichas no lograron inactivar 1 mg de EEA calentándolas a 100°C.43
Reichert y Fung, encontraron que la EEB y la EEC pierden rápidamente su actividad durante los primeros 10 a 30 minutos, cuando se calentaron a 80 y 100°C; observaron también que, después de 24 horas, en estas enterotoxinas calentadas se presentaba cierto grado de reactivación.3,6 Humber y colaboradores publicaron que en la inactivación de las enterotoxinas influye el pH y la composición del medio de calentamiento.25

Tatini, publicó una revisión donde señaló que la estabilidad de las enterotoxinas es influenciada por la naturaleza del alimento, el pH, la presencia de sal y el tipo de enterotoxina. Encontró que la EEA es más estable al calor a pH 6.0 que a pH 4.5 - 5.5, mientras que ocurre lo contrario con la EED.48 Reichert y Fung, publicaron, posteriormente, datos relativos a la reactivación de las enterotoxinas calentadas. Encontraron que esta reactivación era mayor cuando la toxina se calentaba a 70 o a 80°C, que cuando se calentaba a 100 ó 110°C.3,6 Lee y colaboradores publicaron que el tiempo necesario para inactivar el 90% de EEB en un regulador de veronal a 110°C fue 18 minutos, y en caldo de carne 60 minutos, lo que indica un efecto protector de las proteínas.31

La información disponible indica que no son fáciles de inactivar por el calor las enterotoxinas en los alimentos y que a mayor cantidad presente se requerirá de mayor temperatura para disminuir la actividad de éstas, por lo que los tratamientos térmicos usuales aplicados a los alimentos, como la pasterización y la cocción, no garantizan que se destruyan. Por lo anterior, se ha intentado la inactivación de las enterotoxinas por otros medios.

Stelma y Bergdoll, llevaron a cabo la carboximetilación de 5 ó 6 residuos de histidina de la EEA y observaron una ligera reducción en la capacidad de la enterotoxina para reaccionar con su anticuerpo específico y una reducción importante en su toxicidad. La pérdida de la toxicidad de esta enterotoxina no se asoció con un cambio conformacional y sugirieron que podía deberse a la modificación de un residuo de aminoácido dentro del sitio activo de la molécula.44

Síntesis de las Enterotoxinas

Bergdoll y colaboradores publicaron evidencias que indican que las enterotoxinas EEB y EEC se sintetizan en forma diferente a las EEA, EED y EEE. La cantidad de EEB y EEC producidas de una cepa a otra, y a veces por la misma cepa, varía considerablemente, mientras que la cantidad producida por diferentes cepas productoras de EEA, EEC y EEE es muy uniforme. Las cepas que producen grandes cantidades de EEB o EEC (200-500 mg/mL o más para B) pueden perder esta capacidad por resiembras continuas.11

Casman publicó la conversión de 31 cepas no enterotoxigénicas en productoras de EEA, utilizando un fago bacteriano obtenido de la cepa P542D de Staphylococcus aureus, la cual es productora de EEA.15 Jarvis y Lawrence también encontraron que 2 cepas de Staphylococcus aureus no enterotoxigénicas se volvieron productoras de EEA, después de ser lisogenizadas con el fago de la cepa P542D de Staphylococcus aureus.26 Dornbush y colaboradores, trataron 4 cepas enterotoxigénicas (resistentes a la meticilina) con acriflavina y vieron que estas cepas perdieron su capacidad de producir EEB y su resistencia a la meticilina. Estos autores sugirieron que los genes responsables de la resistencia a la meticilina y de la producción de EEB estaban localizados en el mismo plásmido.22 El mismo autor, posteriormente, obtuvo evidencias que indican la presencia de dos plásmidos; uno con determinantes genéticos para producción de penicilinasa y otro para la resistencia a la meticilina y para la producción de EEB.6,21 Shahita y Shafer y sus colaboradores publicaron el hallazgo de un plásmido que determina genéticamente la producción de EEB.40,42

Varios investigadores han propuesto la participación de fagos y trasposones.12,13,14,15,21,23, 26,27,28,29,37,41,42 Friedman propuso que la superficie celular participa en forma importante en la producción de EEB, porque los compuestos con actividad tensoactiva (detergentes) y otras sustancias que bloquean la síntesis de la pared celular, inhiben la producción de EEB. Czop y Bergdoll, estudiando la producción de EEA, EEB y EEC por formas L, encontraron que sólo las cepas productoras de EEA continuaban produciendo enterotoxina; a partir de estos resultados, sugirieron que la producción de EEB y EEC puede estar relacionada con la superficie celular.19 Markus, McLean y Morse y sus respectivos colaboradores publicaron que la EEB se produce en el inicio de la fase estacionaria.32,35 Markus y Silverman publicaron posteriormente que la EEA es producida durante la fase logarítmica.33

Wu y Bergdoll encontraron que, en el medio sintético propuesto por ellos, la producción de EEB era paralela al crecimiento del microorganismo, hasta que se agotaban algunos aminoácidos. En este punto, la producción de EEB cesaba, mientras que el crecimiento continuaba por algunas horas.51 Czop y Bergdoll demostraron que en un medio de digerido pancreático de caseína, la EEA y la EEB se produjeron durante todas las fases del crecimiento.18 Surgalla, trabajando con cepas de Staphylococcus aureus productoras de enterotoxinas (posteriormente se demostró que eran productoras de toxinas A y B), en un medio compuesto por arginina, cisteína, glicina, sulfato de amonio, 3 vitaminas, 3 sales y glucosa, concluyó que se requiere de la arginina y de la cisteína para la producción de ambas enterotoxinas.47

Wu y Bergdoll, demostraron la síntesis de EEB por la cepa S-6 en un medio que contenía 18 aminoácidos, sulfato de amonio, 5 sales inorgánicas y 2 vitaminas. Observaron que la arginina y la cisteina se requieren en grandes cantidades, pero la arginina fue esencial para la iniciación del crecimiento y fue un factor limitante para la producción de la enterotoxina 51. Miller y Fung, utilizando un medio que contenía arginina, cisteína, fenilalanina, 6 sales inorgánicas, 4 vitaminas y glutamato monosódico como única fuente de energía y trabajando con la cepa S-6, observaron que aumentando la concentración de aminoácidos no aumentaba ni el crecimiento del microorganismo ni la producción de enterotoxina. Informaron también que, cuando se usaba glucosa como única fuente de energía, se requería de adicionar prolina y valina, y concluyeron que el factor limitante para el crecimiento y la producción de toxina en este medio era la biosíntesis de uno o más aminoácidos.34 Por los trabajos señalados anteriormente se puede decir que la producción de enterotoxinas está asociada con el metabolismo de uno o más aminoácidos en particular, como la arginina, cistina, serina, treonina, prolina y glicina.16

En una revisión de Bergdoll y colaboradores en 1974, concluyeron que la EEA y la EEB son metabolitos primarios y que se producen durante todas las fases de crecimiento. La presencia de glucosa en el medio de cultivo disminuye la producción de enterotoxina y el crecimiento, y la producción de EEB puede ser estimulada por la presencia de ácidos grasos.11 Altenbern posteriormente, con base en sus investigaciones, ratificó las afirmaciones anteriores.1

Algunos investigadores han publicado la secuencia completa de los nucleótidos de los genes que codifican para la producción de la EEB, EEA y EEE; encontrando similitud entre los que codifican para las dos últimas.13,17,28

A la fecha las EEA, EEB, EEC1 y EED están siendo clonadas, tratando de que la parte del cromosoma que lleva el gene que codifica para la producción de enterotoxina sea transferida a un plásmido el cual posteriormente sea introducido en E. coli.8

La producción de enterotoxinas es especie-específica, aunque una sola cepa de Staphylococcus aureus puede sintetizar varias toxinas.30

Actualización normativa

A finales del año 2002 se publicaron en el diario oficial de la federación dos Normas Oficiales Mexicanas, en donde se incluyó la búsqueda de enterotoxinas estafilocócicas, en la NOM-184-SSA1-2002. Leche fórmula láctea y producto lácteo combinado. Especificaciones Sanitarias, publicada el 23 de octubre de 2002. Esta norma aplica para productos deshidratados como la leche en polvo. Asimismo, la Norma Oficial Mexicana de Emergencia. NOM-EM-006-SSA1-2002. Especificaciones microbiológicas para productos procesados en los establecimientos dedicados al sacrificio, faenado de animales para abasto, corte deshuese, envasado, almacén y expendio. Publicada el 19 de diciembre de 2002. Esta norma aplica para carne refrigerada, congelada, carnes envasadas al vacío o en atmósferas modificadas y carne molida refrigerada.

Sin embargo, no existía en los métodos oficiales alguno que incluyera la determinación de enterotoxinas estafilocócicas, por lo que el 10 de septiembre de 2003 se publicó en el Diario Oficial de la Federación el proyecto de Norma Oficial Mexicana. PROY-NOM-210-SSA1-2002. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos y toxinas microbianas, en donde se incluye la determinación de las toxinas estafilocócicas. Cabe aclarar que hasta la fecha según tenemos entendido aún no se han publicado estos métodos como oficiales en forma obligatoria. También existe otro proyecto de Norma también relacionado con productos cárnicos que es el PROY-NOM-213-SSA1-2000. Productos cárnicos procesados. Especificaciones sanitarias. Métodos de prueba, que aplica a cárnicos curados crudos, cocidos envasados, curados madurados, empanados o rebosados congelados, desecados, secos, salmuera o en salmuera donde se incluye también la determinación de la enterotoxina estafilocócica. Cabe aclarar que, en todas las normas oficiales anteriormente mencionadas, se pide que sean negativas a la presencia de las enterotoxinas estafilocóccicas.

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Fuente:
Énfasis Alimentación Latinoamérica. Publicaciones Técnicas.

 

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